Technologie des gènes

Production de fragments d'ADN par génie génétique

Identifier et isoler un gène spécifique de quelques centaines de bases parmi les millions de bases de l'ADN eucaryote est un véritable défi. Les scientifiques utilisent trois techniques principales pour créer des fragments d'ADN :

1. L'utilisation de la transcriptase inverse pour convertir l'ARNm (ARN messager) en ADNc (ADN complémentaire).
2. L'utilisation d'une endonucléase de restriction pour couper la molécule d'ADN au niveau d'une séquence spécifique.
3. Utilisation d'une machine à gènes pour créer un gène basé sur une protéine dont la structure et la composition sont connues.

Transcription inverse

Ce processus utilise une enzyme particulière appelée transcriptase inverse. Cette enzyme est naturellement présente dans les rétrovirus tels que le VIH, et elle crée des brins d'ADN à partir des molécules d'ARNm.

• Dans les cellules, les ARNm correspondent à la séquence génétique, et les ribosomes les lisent pour synthétiser des molécules de polypeptides (protéines). Ce processus est connu sous le nom de traduction.
• Une cellule qui produit naturellement une protéine doit contenir de grandes quantités d'ARNm de cette protéine, qui peuvent être isolées. Par exemple, les cellules bêta des îlots de Langerhans dans le pancréas sécrètent de l'insuline et doivent contenir de grandes quantités d'ARNm d'insuline. L'ARNm de l'insuline peut donc être extrait des cellules bêta.
• Après l'extraction de l'ARNm souhaité, ils peuvent être traités avec l'enzyme transcriptase inverse, qui polymérise les désoxyribonucléotides et crée des molécules d' ADNc simple brin qui ont une séquence de base complémentaire à celle de l'ARNm.

• Les molécules d'ADNc obtenues sont ensuite traitées par l'ADN polymérase dans le processus de réaction en chaîne de la polymérase (PCR). L'ADN polymérase synthétise un brin d'ADN complémentaire à partir de l'ADNc, créant ainsi un ADN double brin. Elle réplique également les molécules d'ADN en cycles répétés, ce qui amplifie le nombre de fragments d'ADN.
• Leprincipal avantage du processus de transcription inversepour isoler les gènes est que le produit créé à la fin est un ADNc qui ne contient pas d'ADN non codant (introns). Ceci est important pour l'insertion de gènes dans les procaryotes car les systèmes procaryotes ne peuvent pas éliminer les introns.

Endonucléases de restriction

Les endonucléasesde restriction (ER) sont des enzymes qui font naturellement partie du mécanisme de défense des bactéries. Elles agissent en coupant les molécules d'ADN étrangères.

Il existe différents types d'ER dont les sites actifs sont complémentaires à des séquences nucléotidiques de bases spécifiques. Ces séquences sont appelées sites de reconnaissance, car chaque ER crée des incisions dans l'ADN spécifiquement à ces endroits.

Nous pouvons classer les ER en deux groupes principaux en fonction de la façon dont elles coupent l'ADN :

1. Les ER qui incisent l'ADN à l'endroit exact sur les deux brins créent deux extrémités émoussées.
2. Les ER qui coupent les deux brins d'ADN à des positions éloignées de quelques bases l'une de l'autre entraînent la création d'extrémités décalées avec des bases d'ADN exposées (bases sans paires complémentaires). Ces bases d'ADN non appariées peuvent se joindre à un ADN avec des bases complémentaires. Ces extrémités sont également appelées extrémités collantes car elles peuvent facilement rejoindre d'autres échantillons d'ADN avec des extrémités collantes. Les sites de reconnaissance de ces types d'ER ont une séquence palindromique, ce qui signifie qu'ils sont lus de la même façon sur les brins avant et arrière.

Fig. 3 - Création de fragments d'ADN avec des extrémités collantes à l'aide d'enzymes de restriction .

La machine à gènes

La machine à gènes est la technique la plus moderne qui permet aux scientifiques de créer des fragments d'ADN en laboratoire à l'aide d'ordinateurs et d'appareils spéciaux.

Ils identifient d'abord la protéine qui les intéresse et examinent sa séquence d'acides aminés constitutifs. Ensuite, les scientifiques peuvent déterminer les séquences d'ARNm et d'ADN qui pourraient coder cette protéine en utilisant le code génétique à l'envers.

La séquence d'ADN obtenue peut ensuite être entrée dans l'ordinateur. L'ordinateur vérifie les fragments d'ADN sur le plan de la biosécurité et de la sûreté biologique, en s'assurant qu'il respecte les différentes réglementations éthiques et qu'il n'enfreint pas les réglementations internationales. L'ordinateur crée ensuite une série de petits nucléotides monocaténaires dont les séquences se chevauchent dans le cadre d'un processus automatisé. Ces brins sont appelés oligonucléotides et peuvent être assemblés pour générer la séquence d'ADN du gène souhaité. Enfin, le brin d'ADN conçu est amplifié et converti en molécule d'ADN double brin à l'aide de la PCR.

La technique de la machine à gènes est précise et peut être réalisée en seulement dix jours. Elle crée également des brins d'ADN qui ne contiennent pas de régions non codantes (introns) et qui peuvent être transcrits et traduits par les systèmes procaryotes.

Tableau 1. Résumé des avantages et des inconvénients des différentes technologies génétiques.